Ngày 4 tháng 8 năm 1534, ở độ tuổi 18, Marie đã kết hôn với Louis II d'Orléans, Công tước xứ Longueville, tại Cung điện Louvre, trở thành Công tước phu nhân xứ Longueville. Marie và Louis được ghi nhận là có một cuộc hôn nhân hạnh phúc nhưng ngắn ngủi. Ngày 30 tháng 10 năm 1535, Marie sinh hạ con đầu lòng tên François (Công tước xứ Longueville tương lai), nhưng vào ngày 9 tháng 6 năm 1537, Louis qua đời tại Rouen, khiến Marie trở thành mọt góa phụ cùng với một đứa trẻ trong bụng ở độ tuổi 21. Ngày 4 tháng 8 cùng năm, Marie sinh hạ đứa con trai thứ và đứa trẻ được đặt tên là Louis theo tên người chồng quá cố nhưng cũng sớm qua đời. Trong suốt quãng đời còn lại, Marie luôn gìn giữ bức thư cuối cùng từ Louis, bon mari et ami (người chồng và người bạn tốt của cô), trong đó đề cập đến căn bệnh của anh và giải thích sự vắng mặt của anh ở Rouen (Bức thư hiện vẫn có thể được nhìn thấy tại Thư viện Quốc gia Scotland) . [1]Và với con trai François, khi Marie đã trở thành Vương hậu Scotland, hai mẹ con vẫn trao đổi thư từ với nhau. Vào ngày 22 tháng 3 năm 1545, François gửi một đoạn dây để cho biết mình cao bao nhiêu, và vào ngày 2 tháng 7 năm 1546, François gửi cho Marie bức chân dung của mình. [2]